蛋白质羰基含量测定试剂盒使用说明！
蛋白质羰基是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标志，其含量高低表明蛋白质氧化损伤程度的大小，是衡量蛋白质氧化损伤的主要指标。在氧化应激过程中 ，自由基对蛋白质的作用包括蛋白质肽链断裂 、蛋白质分子相互间交联聚合，蛋白质氨基酸发生氧化脱氨反应 、氧自由基攻击蛋白质还原性基团、脂类氧化裂解所产生的丙二醛与蛋白质上的氨基产生分子间的交联等。
检测原理：
羰基与2,4-二硝基苯肼反应生成红色2,4-二硝基苯腙，在370nm处有特征吸收峰。
实验所需用品及：天平、恒温水浴锅、低温离心机、漩涡震荡仪 、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水、无水乙醇 、乙酸乙酯 。
试剂组成和配制：
提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存 。
试剂一：粉剂0.1g×5支，4℃避光保存 。（使用前根据样品数，每支加1mL水溶解，每支为10个样品用量）
试剂二 ：液体6mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂三：液体6mL×1瓶 ，4℃保存。
试剂四 ：液体15mL×1瓶，4℃保存。
试剂五 ：根据测定样品量，将乙酸乙酯和无水乙醇等体积混合。
试剂六：液体30mL×1瓶，4℃保存。
样品处理：
组织样品 ：称取约0.1g组织样品 ，加入1mL提取液 ，充分匀浆后于4℃，5000rpm离心10min ，取上清 ，加入0.1mL试剂一 ，室温放置10min ，4℃，12000rpm离心10min ，取上清，然后取20μL测定蛋白含量，剩余的作为待测样品 。
测定步骤和操作表：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至370nm，蒸馏水调零。
2、操作表
空白管
测定管
样品（μL） 60 60
试剂二（μL） 120
试剂三（μL） 120
混匀，37℃避光反应1h
试剂四（μL） 150 150
静置5min，4℃，12000rpm离心15min，弃上清，留沉淀
试剂五（μL） 300 300
漩涡混匀，4℃，12000rpm离心10min ，弃上清 ，留沉淀
试剂五（μL） 300 300
漩涡混匀 ，4℃ ，12000rpm离心10min，弃上清，留沉淀
试剂五（μL） 300 300
漩涡混匀 ，4℃，12000rpm离心10min，弃上清，留沉淀
试剂六（μL） 300 300
漩涡混匀 ，37℃温育15min，沉淀全部溶解后，4℃ ，12000rpm离心15min，取上清200μL，微量石英比色皿/96孔板 ，试剂六调零 ，测定OD370。
空白管 测定管
样品（μL） 60 60
试剂二（μL） 120
试剂三（μL） 120
混匀，37℃避光反应1h
试剂四（μL） 150 150
静置5min ，4℃ ，12000rpm离心15min ，弃上清，留沉淀
试剂五（μL） 300 300
漩涡混匀 ，4℃，12000rpm离心10min ，弃上清 ，留沉淀
试剂五（μL） 300 300
漩涡混匀，4℃，12000rpm离心10min ，弃上清 ，留沉淀
试剂五（μL） 300 300
漩涡混匀，4℃，12000rpm离心10min ，弃上清，留沉淀
试剂六（μL） 300 300
漩涡混匀，37℃温育15min ，沉淀全部溶解后，4℃，12000rpm离心15min，取上清200μL ，微量石英比色皿/96孔板 ，试剂六调零，测定OD370。
计算公式：
蛋白质羰基含量（μmol/mg prot）= 227.27×（OD370测定管－OD370空白管）÷Cpr
原创作者：南京5357cc拉斯维加斯首页入口生物技术有限公司
