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溶菌酶检测试盒说明书
本公司比浊法测定溶菌酶活性主要有三种：
1、自身对照法：适用于样本数量较少 ，或者样本有混浊或有颜色（如血液红色）；
2、空白对照法 ：适用于样本量多且样本比较澄清 ；
3、标准曲线法。
一 、测定原理：
在一定浓度的混浊菌液中，由于溶菌酶能水解细菌细胞壁上肽聚糖使细菌裂解而浓度降
低 ，透光度增强 ，故可以根据透光度变化来推测溶菌酶的含量 。
二 、试剂组成及配制 (30T/28 样)
1、试剂组成 ：
试剂一：菌粉 ，5mg×4 支 ，2～8℃干燥保存，有效期 6 个月。
试剂二：菌粉溶剂，100ml×1 瓶 ，2～8℃保存，并每月放微波炉中温消毒 20 秒 ，有效期 6
个月。
试剂三：标准品，粉剂 2mg×1 支（活力为 8 万单位/mg） ，2～8℃干燥保存，有效期 6 个月。
[注]：试剂盒严格按照上述方法保存有效期可延至一年。
2、试剂配制 ：
（1）、贮备菌液的配制：
取 5mg/支的菌粉 1 支 ，倒入匀浆管中，加菌粉溶剂 1ml，轻轻缓慢上下旋转研磨
3 分钟（切勿溅出），即为贮备菌液，将其取出后置 2～8℃冰箱密封保存一周左右 。
（2）、应用菌液的配制 ：
按贮备菌液:菌粉溶剂=1:19 进行配制 ，需多少配多少。剩下的应用菌液 2～8℃可
保存一周左右。是现用现配，用时摇匀。
（3） 、标准品的配制：
① 、标准品贮备液的配制：
每支准确加双蒸水 1.0ml 配成 2mg/ml 的标准品贮备液。2～8℃可保存 7～10 天。
②、标准品应用液的配制：
临用时按标准品贮备液∶双蒸水=1∶799 比例稀释成 2.5µg/ml（即 200U/ml）的
标准品应用液 ，需多少配多少。2～8℃保存，可保存 7～10 天。
附录Ⅰ ：自身对照法测定溶菌酶
（适用于样本数量较少，或者样本有混浊或有颜色 ，如血液红色）
[注] ：本法用分光光度计 530nm 处,1cm 光径比色皿测得是样本或标准的透光度值
1、操作步骤
①、将配制好的应用菌液，标准应用液及所需检测的样本均放入 37℃水浴箱中预温 5 分钟
以上 。使菌液 ，标准液及检测样本的温度达到 37℃。
② 、将可见分光光度计于 530nm 处,1cm 光径比色皿,以双蒸水调透光度 100% (比色皿准备两
只,一只用于调透光度 100%,一只用于测定)。
③、往相应编号的试管中加入 0.2ml 待测样本 ，取 2ml 应用菌液迅速冲入试管中，立即混
匀并计时。(标准品应用液取 0.2ml 双蒸水,加入 2ml 应用菌液,其它操作与测定相同)
④、迅速倒入比色皿中在可见分光光度计 530nm处比浊，5 秒时读取透光度值T0, 比色皿不
要取出，在 2 分 5 秒时读取透光度值T2；
[注]：如 5 秒时来不及读数 ，可 20 秒时读取调透光度值T0,在 2 分 20 秒时读取透光度值T2，标准管需同样
操作。
⑤ 、求出 2 次透光度的差值（△T= T2-T0）。
[注]：用同一比色皿每检测一个样本后均要用双蒸水冲洗干净，才可再放第二个样本或标准品应用液。
2、计算公式：
5 2 1
4 3
[ ] [ ] [ ]
2 0
[ ] [ ]
2 0 / 2.5 / 200 /
UT UT
μg ml ST ST μg ml U ml
− = × −
注 注 注
注 注
溶菌酶含量 测定透光度 测定透光度 标准品浓度 样本测试前
（ ） 标准透光度 标准透光度 （ 即） 稀释倍数 ×
[注 1]：UT0为测定管加应用菌液反应 5 秒钟时的透光度。
[注 2]：UT2为测定管加应用菌液反应 2 分零 5 秒时的透光度。
[注 3] ：ST0为标准管加应用菌液反应 5 秒钟时的透光度。
[注 4] ：ST2为标准管加应用菌液反应 2 分零 5 秒时的透光度 。
[注 5]：2.5µg/ml 即 200U/ml 即 1µg = 80U
3 、计算举例：
例 1：取唾液用生理盐水 1:1 稀释后，取 0.2ml按上述操作进行检测 ，测得测定管透光度T0值
为 19.1，测定管透光度T2值为 21.3,标准管透光度T0值为 30.0 ，标准管透光度T2值为 33.5，标
准管浓度为 2.5µg/ml，则计算如下：
2 0
2 0 / 2.5 / 200 /
21.3 19.1 2.5 / 2
33.5 30.0
3.14 /
251.43 /
UT UT
g ml ST ST g ml U ml
g ml
g ml
U ml
μ μ
μ
μ
− = × −
− = ×× −
=
=
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溶菌酶含量 测定透光度 测定透光度 标准品浓度 样本测试前
（ ） 标准透光度 标准透光度 （ 即） 稀释倍数 ×
例 2：罗非鱼血清的溶菌酶测定：
取罗非鱼血清原液 0.2ml 按上述操作进行检测，测得测定管透
光度T0值为 11.9，测定管透光度T2值为 16.3，标准管透光度T0值为 26.4，标准管透光度
T2值为 29.5,标准管浓度为 2.5µg/ml ，则计算如下：
2 0
2 0 / ml 2.5 / 200 /
16.3 11.9 2.5 /
29.5 26.4
3.548 / l
283.871 / l
UT UT
g ST ST g ml U ml
g ml
g m
U m
μ μ
μ
μ
− = × −
− = × −
=
=
溶菌酶含量 测定透光度 测定透光度 标准品浓度
（ ） 标准透光度 标准透光度 （ 即 ）
例 3 ：鱼肝脏匀浆的溶菌酶测定
①、样本前处理：
取鱼肝脏称重，按肝重量:生理盐水体积=1:19 制成 5%组织匀浆（具体参见本所实验
方法学）。然后将制得的匀浆 8000～10000 r/min，离心 10～15 分钟 ，离心后透光度上层
脂肪较多，可用棉签将脂去掉，吸取中间较澄清液体（仍有浑浊）进行检测。
②、自身对照法检测结果 ：
测定管透光度T0值为 21.7，测定管透光度T2值为 24.5 ，标准管透光度T0值为 26.7 ，
标准管透光度T2值为 29.6,标准管浓度为 2.5µg/ml ，5%匀浆蛋白含量为 4.203mgprot/ml，
则计算如下：
2 0
2 0 / mgprot 2.5 / 200 / mgprot ml
24.5 21.7 2.5 / 4.203mgprot ml 29.6 26.7
0.574 / gprot
45.944 / gprot
UT UT
g ST ST g ml U ml
g ml
g m
U m
μ μ
μ
μ
− = ×÷ −
− = ×÷ −
=
=
溶菌酶含量 测定透光度 测定透光度 标准品浓度 待测样本蛋白浓度
（ ） 标准透光度 标准透光度 （ 即 ）（ /
/
）
附录Ⅱ ：空白对照法测定溶菌酶
（适用于样本量多且样本比较澄清）
[注]：本法用分光光度计 530nm 处,1cm 光径比色皿测得是样本或标准的透光度值
1 、操作表 ：（操作在冰水浴中进行） ：
[注]：冰水浴即自来水中加几块冰 。
空白管 标准管 测定管
双蒸水（ml） 0.2
2.5µg/ml 溶菌酶标准应用液（ml） 0.2
样本（血清、尿、稀释的唾液等）（ml） 0.2
应用菌液（ml） 2.0 2.0 2.0
混匀，37℃准确水浴 15 分钟，立即取出置于 0℃以下的冰水浴中 3 分钟，逐管取出
倒入 1cm光径比色皿中，530nm处以双蒸水调透光度 100% ，比色，测各管透光度T15（T15即
37℃水浴 15 分钟后的透光度值）。
[注 1]：比色时可能在比色皿表面有水雾形成，请将比色皿擦干净后再比色 。
[注 2]：测试过程中为消除每只测定管之相互间的干扰，所以必须在每支管子测定前将比色皿用双蒸水冲
洗干净。
[注 3]：OT15 为水浴 15 分钟后的空白管透光度 ，UT15 为水浴 15 分钟后测定管的透光度，ST15 为水浴 15
分钟后标准管的透光度。
2、计算公式：
15 15
15 15 / 2.5 / 200 /
UT OT
μg ml ST OT μg ml U ml
− = × −
溶菌酶含量 测定透光度 空白透光度 标准品浓度 样本测试前
（ ） 标准透光度 空白透光度 （ 即） 稀释倍数 ×
3 、计算举例：
取唾液用生理盐水 1:1 稀释后，取 0.2ml按上表进行检测，测得空白管透光度T15值为
29.8，测定管透光度T15值为 44.7,标准管透光度T15值为 58.1，标准管浓度为 2.5µg/ml ，
则计算如下：
15 15
15 15 / 2.5 / 200 /
44.7 29.8 2.5 / 2
58.1 29.8
2.63 /
210.6 /
UT OT
g ml ST OT g ml U ml
g ml
g ml
U ml
μ μ
μ
μ
− = × −
− = ×× −
=
=
溶菌酶含量 测定透光度 空白透光度 标准品浓度 样本测试前
（ ） 标准透光度 空白透光度 （ 即） 稀释倍数 ×
附录Ⅲ ：标准曲线法测定溶菌酶
1、标准曲线的制备：
①、标准液的配制：
将标准品 2mg 准确加双蒸水 1.0 ml ，混匀 ，配成 160000 U/ml 的标准品贮备液，
再取适量的标准品贮备液，用双蒸水分别稀释成 2000 U/ml 、1000 U/ml、500 U/ml、
250 U/ml、125 U/ml、62.5 U/ml、31.25 U/ml、15.625 U/ml 的不同浓度的标准液。
②、将应用菌液及各种浓度的溶菌酶标准液置于 0℃的冰水中预冷 5 分钟以上 。
③ 、按下表进行操作：（操作在冰水浴中进行）
空白管 测定管
双蒸水（ml） 0.2
不同浓度标准液（ml） 0.2
应用菌液（ml） 2.0 2.0
37℃准确水浴 15 分钟，立即取出置于 0℃以下的冰水浴中 3 分钟，逐管取出 ，倒入 1cm
光径比色皿中，530nm处，双蒸水调透光度 100%，比色，测各管透光度T15（T15即 37℃水浴 15
分钟后的透光度值）。
④、作坐标图：
以各标准管的单位浓度为横坐标，以各管透光度差值为纵坐标作图 。
2、按方法二进行测定然后查标准曲线（但不如计算公式方便）
[注]：因试剂盒内带有标准品，每次只需做 1～2 只标准管即可以，一般不需要作标准曲线。
溶菌酶标准曲线
0 500 1000 1500 2000
50
45
40
绝对透光度值（△
T值）35
30
25
20
15
10
5
0
标准品浓度（U/ml）
注意事项
1 、菌粉尽量研磨碎 、磨匀 ，研磨时防止菌液溅出。
2 、菌液、标准品、样本必须先在 0℃冰水浴中预冷 5 分钟以上 。37℃水浴前的操作在冰
水浴中进行 。
3、为了避免检测误差，空白管单独用一个比色皿比色 ，每次加样前或比色之前比色杯要先用
自来水冲洗干净，再用双蒸水冲洗 2～3 遍 。
4、比色时各管从冰水中逐个取出比色。比色皿过冷会在皿壁上形成水雾，所以要擦干再比色。
5、试管要用同一批次。
6、为了减少误差 1cm 光径的比色皿也要进行校正 。
7、比色与计时要同步，准确控制时间。为二个人或者用自动生化分析仪。
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