明胶酶谱法电泳试剂盒操作步骤哪一步*关键 ，5357cc拉斯维加斯首页入口生物为您解答 ！
产品简介：
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以无活性的酶原形式分泌，活化后能够降解细胞外基质的胶原蛋白 ，又称胶原酶。通过影响细胞外基质，胶原酶参与胚胎发育、形态发生、组织重塑等过程 ，并参与炎症、肿瘤 、心血管、神经等许多疾病过程。血浆与组织中的MMP-2、MMP-9参与各种生理与病理过程，其在临床诊断和治疗中的意义日益受到重视。
明胶酶谱法被广泛地用于明胶酶A(MMP-2)和明胶酶B(MMP-9）的测定，由于有活性的酶和无活性的酶原存在分子量的差别 ，明胶酶谱法可有效分离有活性的酶和无活性的酶原 。而且能分离紧密结合在具有活性的酶上的内源性组织抑制剂(TIMPs).明胶酶谱法测定原理为 ：将含酶的样本，一般是培养细胞匀浆或组织提取物 ，在含有SDS的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，作为酶底物的明胶已混合在胶中。电泳完成后，用Triton X-100清洗去除SDS以使酶恢复活性，经过一定时间的孵育使酶充分水解底物，染色后可显示清晰的酶水解条带。根据条带的面积和密度可定量测定酶活性。
检测步骤：
1 制备含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝胶 ：推荐分离胶浓度为8% 。按照标准程序制备SDS PAGE凝胶。将10 × substrate G 融化 ，并90 ºC 加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加入10 × substrate G 并使之稀释10倍，混匀后加入过硫酸铵和TEMED ，等待凝胶聚合 。
2 待测样品1:1 稀释于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制 ：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue) ，混合后直接上样。切勿加热变性，并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液 。可通过预试验确定加样量，使用普通蛋白预染Marker 即可。
阳性对照(可选步骤) ：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血与100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等体积混合，取5-15μl 上样 。
注：因为全血成分复杂,MMP活性较低，的方法是将全血中白细胞进行分离做阳性对照
3 低电流恒流电泳 ，每一块小胶电流为20 mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。
4 洗涤凝胶：取出凝胶，去除浓缩胶，放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶 ，然后加入10 ml 1× BufferA(用蒸馏水稀释)，室温漂洗凝胶2 × 30 分钟。中间换液。
5 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸馏水稀释)，室温或37ºC 孵育1~5 小时。阳性对照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小时即可显示 。如MMP 活性低 ，应延长孵育时间为10小时或过夜。
6 显色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液（操作步骤见后面所附SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书）。凝胶的大部分区域被深染，在有MMP 条带的位置不被染色而形成透亮区域 。
透明区域的位置和范围指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。阳性对照将在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9) 、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出现透明条带。
7 条带扫描：将凝胶放在扫描仪上扫描 。虽然MMP条带透明 ，但凝胶背景并非真正全黑。解决办法：可用非透射光扫描，或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示 ，并尽量设置为黑色。MMP 条带则为白色，这种背景黑条带白的格式是英文论文中*常见的格式。
参考文献：
1. Nagase H ａnd Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494
2. Heussen C, ａnd Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide
gels containing sodium dodecyl sulfate ａnd copolymerized substrates. Anal. Biochem，1980, 102,196–202
