荧光定量数据分析准则

阅读次数：1031 发布时间：2020/10/20 17:28:13

荧光定量数据分析准则

荧光定量是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。

荧光定量PCR技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程。随着PCR 反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，结合相应的软件对产物进行分析，可以得到荧光扩增曲线，计算待测样品初始模版的量。实时荧光定量PCR技术是一次由定性技术向荧光定量定量技术的飞跃，运用该项技术，可以对DNA、RNA样品进行相对定量、绝对定量和定性分析。

判断数据的有效性，可以结合扩增曲线，溶解曲线，标准曲线以及NTC（检验引物）和NRC（检验模板）来分析。

1.扩增曲线应呈现出平滑的S型曲线，起始无扩增，起峰时间正常，由扩增曲线得到的Ct值是判断实验成功与否的重要参考，Ct值有一定的可信范围，临床检验小于33，科学研究小于38，内参基因一般小于20，且样品间内参的Ct值差不超过1，表明内参基因表达量稳定，复孔Ct值标准偏差不超过0.5；

2.溶解曲线应呈现单峰，峰的宽度较小，NTC和NRC无特异的峰出现；

3.标准曲线的斜率范围-3.58~-3.10，对应引物的扩增效率范围90%~110%，R2代表线性拟合度，一般大于0.95；

4.NTC用于判断反应是否存在模板污染，引物是否特异，是否会形成引物二聚体。NTC状况是没有扩增，即扩增曲线和溶5.解曲线与基线重合，没有Ct值。NTC有扩增的情况下，至少与加入模板体系的Ct值相差5或10以上；

6.NRC用于判断cDNA模板中是否存在基因组DNA残留，可以间接反映RNA中基因组DNA污染情况，理想情况下，NRC没有Ct值，有Ct值的话至少要跟加入cDNA模板体系的Ct值相差5或10以上。