5357cc拉斯维加斯首页入口生物科普：ELISA 标准操作及技术服务的常见问题
ELISA 标准操作要点
优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证 ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。ELISA 中用的蒸馏水或去离子水 ，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的本公司要求使用的纯化水电导率小于 1.5μs/cm。
1. 标本的采取和保存
大部分 ELISA 检测均以血清为标本 。血清标本可按常规方法采集 ，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以 HRP 为标记的 ELISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染 ，菌体中可能含有内源性 HRP，也会产生假阳性反应。一般说来 ，在 5 天内测定的血清标本可放置于 4℃，标本在冰箱中保存时间过长导致血清 IgG 聚合 ，使间接法的试剂本底加深。超过一周测定的需－20℃保存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂 。
抗凝不完全的标本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性 ，建议尽量不用抗凝血尤其是肝素抗凝剂 。
2.加样
加样时应将所加物加在 ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出。
3.保温
在建立 ELISA 方法作反应动力学研究时 ，实验表明，两次抗原抗体反应一般在 37℃经1-2 小时，产物的生成可达顶峰 。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡 。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。由于公司的试剂盒温育是在空气浴中完成，采用水浴会造成值偏高或花板。另外温育中还有边缘效应 ，边上的值会偏高，建议为了客观的判断结果，将质控放在非边缘位置。
4.洗涤
洗涤在 ELISA 过程中虽不是一个反应步骤 ，但却决定着实验的成败。ELSIA 就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来 。可以说在 ELISA 操作中 ，洗涤是*主要的关键技术 ，应引起操作者的高度重视，操作者应严格
按要求洗涤，不得马虎。
洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的 ，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体 。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温 20 ，其浓度可在 0.05%-0.2%之间，高于 0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验
的灵敏度。 洗板时注意各种试剂盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀释，应按要求稀释 ，所用的水电导率在 1.5us/cm 之下 ，洗液如果结晶应待其融解后配制 。保证洗板浸泡时间为 40 秒左右，孔内液体被洗板机吸收得越干净洗涤效果更好，手工洗板防止洗液在孔内形成气泡。
5. 显色和比色
TMB 经 HRP 作用后，约 40 分钟显色达顶峰 ，随即逐渐减弱，至 2 小时后即可完全消退至无色 。TMB 的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间（12-24 小时）不褪，是目视判断的良好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。
酶标比色仪简称酶标仪 ，通常指专用于测读 ELISA 结果吸光度的光度计。酶标仪的主要性能指标有 ：测读速度 、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到 0.001，准确性为±1% ，重复性达 0.5%。酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在 15~30℃ ，使用前先预热仪器 15-30 分钟，测读结果更稳定 。
测读 A 值时，要选用产物的敏感吸收峰，如 OPD 用 492nm 波长 。有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次 ，次在*适波长（W1） ，第二次在不敏感波长（W2），两次测定间不 移动 ELISA 板的位置，*终测得的 A 值为两者之差（W1-W2）。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。
