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当前位置:南京5357cc拉斯维加斯首页入口生物技术有限公司>产品中心>免疫组化实验代做 > 免疫组化技术服务 ，免疫组化实验代测
点击次数：2073 发布时间：2016/3/18 10:00:02
南京5357cc拉斯维加斯首页入口生物服务宗旨：诚信为本；客户至上；欢迎广大老师和学生 ，前来咨询 ！
免疫组化主要步骤:
1.洗载玻片: 将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中,目的是为了是载玻片上的硅胶等除去,同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整,便于组织吸附,然后置于清水中清洗,除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4(大约冲一个小时左右),再将载玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys带正电，而大多数的组织带负电荷，从而产生吸附作用 。
2.包埋组织: 先在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，*后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。
3.切片：将包埋好的组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致，然后调节切片的厚度，一般为5µm,如果比较难切，则可以适当调整厚度，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40°C温水中 。
4.捞组织 ：当组织载玻片置于40°C温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，是组织不起皱纹 ，用载玻片捞组织时，一般取载玻片的下1/3或者下1/2一般每种组织捞5-6张 ，其中2-3张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织 ，做对照使用，这样形成的误差就比较小了，而且捞载玻片的时候方向一致 ，以便观察 ，再将捞出来的载玻片置于架子上 ，放入37°C温箱中烘干 。
5.脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯,依据的是相似相溶的原理.一般在每个试剂中放10min,天气热可以少放几分钟,相反,天气较冷的话,就要适当延长脱蜡时间,一般为12-15min.
6.抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2浸泡10min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2 ，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3min（中火） ，一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次 ，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。
7.血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中5min，洗2次 ，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭起来，然后放入37°C温箱中半小时 。血清稀释10倍（900µlPBS：100µl血清封闭液）。
8.加一抗 ：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清 ，加一抗 ，如果做对照实验，就在对照的组织上加PBS 。加完一抗后于4°C冰箱中保存过夜。
9.加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次 ，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上二抗,然后置于37°C温箱中半小时 。
10.加SABC: 将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次 ，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上SABC, 然后置于37°C温箱中半小时。SABC稀释100倍（990µlPBS ：10µlSABC）。
11.加显色剂: 将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上显色剂。（显色剂的配置 ：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀 ，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀） A：DAB B：H2O2 C：磷酸缓冲液
12.复染: 将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色 ，一般动物组织为半分钟，植物组织3-5min。
13.脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后 ，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min，*后浸泡在二甲苯中 ，搬到通风柜中 。
14.封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干 。
免疫组化的相关试剂：*重要的是选择好一抗、二抗或者还有三抗 ，注意抗体的特异性、效价和交叉反应。
其他常用试剂有 ：
1、0.01M(pH7.4)的磷酸盐缓冲生理盐水（PBS），稀释抗体和洗片子用；
2、清洁液、纯水，洗玻片用
3、多聚赖氨酸处理载玻片 ，防止脱片
4、固定液：4%多聚甲醛或冷丙酮等；
5、15%~30%蔗糖 ，组织脱水用 ；
6、梯度酒精脱水 、二甲苯透明、石蜡包埋 ，或者OCT包埋做冰冻切片；
7、抗原修复液：枸橼酸缓冲液（pH6.0） ；
8、活化剂：EDTA或者Triton X-100；
9 、1%~10%牛血清清蛋白（BSA）封闭液；
10、H2O2，灭活内源性过氧化物酶 ；
11 、显色液：根据你做的酶来选择，如果是HRP就用DAB，如果是AKP ，就用NBT/BCIP，免疫荧光则不需要；
12 、50%缓冲甘油封片液。
更新时间 ：2025/2/9 6:30:22
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