Western blot实验代测有哪些注意事项！

阅读次数：892 发布时间：2019/6/25 14:25:28

通过电泳区分不同的蛋白组分，并转移至固相支持物（膜），通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测。可检测到低至1～5ng（zui低可到10～100pg）中等大小的靶蛋白。

蛋白样品制备的注意事项：

1、细胞数量达5×106

2、将细胞裂解液再离心，收集上清液，加loading煮样5min。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项：

1、做胶：防止漏胶、进气泡以及花胶（水封、插梳子和拔梳子）

2、加样：两边加loading，加样量一样，加样时间要尽量短，以免样品扩散。

3、电泳：将胶夹好放于电泳槽中，加电泳buffer（内外面不能联通），将电压调到90V开始电泳。

转膜注意事项：

1、泡膜：转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移buffer浸泡20min。（1.凝胶若是没在预冷的转膜buffer中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶皱缩，导致出现转移条带变形。2.PVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡）

2、转膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板

3、转膜条件：0.3 250V 1h40min 冰浴中进行转膜（具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，反之则短）

4、避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。

5、夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全。

6、保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样，过大和过小都会影响转膜效率。

7、鸡来源的抗体与PVDF和尼龙膜有较强的结合能力，从而产生较高的背景，故如果选择鸡来源的抗体zui好使用硝酸纤维素膜（NC膜）

关于磷酸化蛋白检测的注意事项：

1、保持待测蛋白处于磷酸化状态！在标本提取液中加入足够的磷酸酶抑制剂（NaF，可以防止去磷酸化），并将标本时刻保持在冰浴中！

2、使用5%的BSA作为封闭试剂！不能使用脱脂奶粉！（因为脱脂奶粉中含有酪蛋白，会出现很高的背景）。

抗体保存注意事项：

1、收到抗体后按要求离心后再打开管盖进行分装盒保存！

2、对于大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在-20℃

2.1 分装的量以一次实验用完为好，zui少不能少于10μl每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。

2.2 复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在4℃，避免再冻起来！

2.3 避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。

3、大部分抗体收到后4℃短暂保存1-2周对抗体活性是没有影响的。

4、长期保存，加入叠氮钠，防止细菌污染。

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